۳-۱-۵- جایگاه حیوانات و مکان انجام آزمایش

بعداز عمل، حیوانات آزمایشی در محل مسقف و محصور، داخل جایگاه‌های انفرادی مخصوص آزمایش نگهداری ‌شدند. این جایگاه طوری طراحی شده بودکه حیوان درآن به‌راحتی جهت آزمایش مهار می‌شود و ضمناً از آزادی نسبی نیز برخوردار بود. ظروف آب و خوراک متصل به جایگاه‌ها بوده وآب به‌صورت آزاد در اختیار حیوانات قرار ‌گرفت(شکل ۳-۱).
آزمایش‌های تجزیهپذیری در دامداری دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت و آزمایشات تولیدگاز در موسسه تحقیقاتی علوم دامی کشور واقع درکرج انجام گردید.آزمایش طیف‌سنجی مادون قرمز نزدیک در مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور واقع در پیکان‌شهر تهران انجام گردید.
شکل ۳-۱- مراحل فیستولهگذاری

۳-۱-۶- روش کیسه نایلونی

در روش کیسه نایلونی نمونههای ۱۰-۵ گرمی در داخل کیسههای از جنس الیاف پلیاستر مصنوعی که نسبت به تجزیه میکروبی در شکمبه مقاوم وغیرقابل هضم است با سوراخهای ۵۰ میکرومتر و ابعاد ۱۸ ×۱۲ سانتیمتری قرارداده و درب کیسهها بهوسیله نخ مسدود شد. زمانهای انکوباسیون (۹۶، ۷۲، ۴۸، ۲۴، ۱۶، ۸، ۴، ۰) ساعت بود. برای هر تیمار در هر ساعت ۳ تکرار تهیه شد بهطوری که درون شکمبه هر دام ۱ کیسه قرار داده شد، بدین صورت که قبل از قرار دادن کیسهها درون شکمبه حیوان کیسهها در داخل کیسهای از جنس پلیاستر با قطر منافذ ۳ میلیمتری قرار داده خواهد شد وسپس کیسه بزرگ که حاوی کیسههای نایلونی است با استفاده از لوله لاستیکی به طول ۳۰ سانتی متر در داخل شکمبه شناور ماند پس از اتمام زمان انکوباسیون کیسهها خارج شده، شسته شده و در معرض جریان آب سرد قرار گرفت تا زمانی که تخمیر متوقف شود آب خارج شده وکاملاً شفاف شد. جهت تبخیر آب کیسهها به مدت ۲۴ ساعت در ۶۵ درجه سانتیگراد قرار گرفت و سپس به منظور تعیین درصد ماده خشک آن، مدت ۲۴ ساعت در دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد در داخل آون قرار داده شد. درصد ماده خشک وپروتئین خام ناپدید شده از طریق فرمولهای زیر محاسبه شد:
۱۰۰ˣ(وزن اولیه خوراکˣدرصد پروتئین)/{(وزن کیسه-وزن کیسه همراه نمونه پس از انکوباسیون)-(وزن کیسه – وزن کیسه همراه نمونه)} =درصد ماده خشک ناپدید شده
۱۰۰ˣ(وزن اولیه خوراکˣدرصد پروتئین)/{(درصد پروتئین باقیماندهˣوزن باقیمانده انکوباسیون) – (درصد پروتئینˣوزن اولیه خوراک)}=درصد پروتئین ناپدید شده
توسط نرمافزارهای موجود تجزیهپذیری بالقوه با استفاده از مدل (ct-e-1) b+a =P محاسبه شد.

۳-۱-۶-۱- عملیات انجام شده پس از خروج کیسهها از داخل شکمبه

پس از پایان یافتن هر زمان تخمیر، کیسههای حاوی مواد خوراکی که در معرض تخمیر شکمبه قرار گرفت و از داخل شکمبه از طریق فیستوله خارج گردید و بلافاصله پس از خارج کردن، کیسهها در آب سرد قرار گرفتند. این کار جهت توقف سریعتر عمل تخمیر میکروبی بر مواد خوراکی داخل کیسهها انجام شد. همچنین این کار باعث شد مواد شکمبهای و بخشی از ذرات ریز که به کیسهها چسبیده، از آن جدا شود. سپس کیسهها در ماشین لباسشویی با آب سرد و به مدت ۱۵ دقیقه با ۶۰۰ دور در دقیقه شستشو داده شد. سپس آنها به انکوباتور منتقل و پس از ۲۴ ساعت خشک شدن، آنها در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد وسپس به مدت ۴۸ ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شدند. درصد تجزیهپذیری هر یک از مواد مغذی، پس از تعیین مقدار آن ماده مغذی در ماده اولیه ودر باقیمانده آن ماده در کیسهها پس از مدت زمان تخمیر با استفاده از رابطه زیر تعیین گردید:
۱۰۰× مقدار ماده مغذی در نمونه اولیه /مقدار ماده مغذی در نمونه باقیمانده – مقدار ماده مغذی در نمونه اولیه = درصد تجزیه پذیری یا ناپدید شدن
رابطه فوق درصد تجزیهپذیری بالقوه را نشان میدهد. وعوامل دیگر از جمله سرعت و میزان عبور مواد از شکمبه را در نظر نمیگیرد. به همین منظور رابطه دیگری برای بیان دقیق تر تجزیهپذیری ارائه گردید که این رابطه تجزیهپذیری موثر مواد خوراکی را نشان داد.
P = a + تجزیهپذیری موثر
که در این رابطه(P) تجزیهپذیری مواد خوراکی،b مواد نامحلول امّا بهطور بالقوه قابل تجزیه،a بخش محلول ماده خوراکی، c نرخ ثابت تجزیه بخشb در واحد زمان و r سرعت عبور مواد از شکمبه میباشد (صوفی، ۱۳۷۹؛ نویدشاد و جعفری صیادی، ۱۳۷۹).
مقدار r بر اساس سطوح مصرف خوراک توسط دام برآورد شد. که مقدار آن در سه سطح، برابر نگهداری، دو برابر نگهداری و بیش از دو برابر نگهداری به ترتیب ۰۲/۰، ۰۵/۰، ۰۸/۰ است و ضرایب a ،b و c با معادله زیر بدست آمد(نویدشاد و جعفری صیادی، ۱۳۷۹):
P = a + b ( ۱ – e –ct )
در رابطه فوق p تجزیهپذیری ماده خوراکی در زمان t وa ،b و c همان پارامترهای فرمول پیشین است. t زمان تخمیر در شکمبه وe مبنای لگاریتم نپری برابر ۷۱۸۲/۲ می باشد. برای محاسبه سریع این ضرایب از برنامه Neway استفاده شد که مدّت زمان تأخیر را هم محاسبه میکند.

۳-۱-۷- روش تولید گاز

روش تولید گاز روشی است که براساس برقرار کردن ارتباط بین گاز تولید شده و قابلیت و میزان انرژی قابل متابولیسم علوفه مقادیر مورد نظر را محاسبه میکند. برای اندازهگیری تولید گاز از روش پیشنهادی منک بهوسیله دستگاه مخصوص که شامل ۵۷ سرنگ ویک اتاقک با دمای ۱±۳۹ درجه سانتیگراد، جهت نگهداری سرنگهاست برآورد شد. سرنگها در داخل دستگاه قرار گرفتند و به صورت دورانی حرکت کردند و در فواصل زمانی مشخص میزان تولید گاز ثبت شد. برای تهیه مایع شکمبه از ۳ رأس دام استفاده شد. در این آزمایش از جیره استاندارد و متناسب با این آزمایش استفاده شد. محلولهای مورد نیاز که استفاده گردید عبارتند از: محلول عناصر اصلی، محلول عناصر کممصرف، محلول بافر یا بزاق مصنوعی، محلول ریزاروزین و محلول احیا کننده. محلول احیا کننده به طور تازه تهیه شد ولی سایر محلولها را توان از قبل تهیه گردید. محلولهای تهیه شده را با هم مخلوط کرده ودر حمام آب گرم (۳۹ درجه سانتیگراد) قرار گرفت. به هنگام افزودن محلول احیاکننده، گاز ۲CO به محلول وارد شد، محلول آبی رنگ اولیه ابتدا به رنگ متمایل به قرمز درآمد و سپس بیرنگ شد. مایع شکمبه وقتی به محلولهای مذکور اضافه شد که شاخص به حالت بیرنگ درآمد، نسبت مایع شکمبه به بافر ۱:۲ بود. افزودن ۲CO پس از وارد کردن مایع شکمبه همچنان ادامه یافت وگاز دادن به مدت یک ساعت ادامه پیدا کرد. تغذیه در حد نگهداری انجام شد و به عنوان یک قانون کلی مایع شکمبه قبل از وعده غذایی صبح تهیه شد. ۲۰۰میلیگرم از نمونه به داخل سرنگهای ۱۰۰ میلیلیتری منتقل شد و به این سرنگها ۳۰ میلیلیتر محلول مایع شکمبه صاف شده حاوی بافر اضافه شد. میزان تولید گاز برای هر یک از تیمارها و تکرارها در زمانهای ۹۶، ۷۲، ۴۸، ۲۴، ۱۲، ۸، ۶، ۴، ۲، ۰ ساعت اندازهگیری و ثبت گردید.

۳-۱-۷-۱- مواد و دستگاههای لازم برای انجام آزمون گاز

۱ – انکوباتور هواکشدار با دقت در دمای ۱/۰ درجه سانتیگراد با ابعاد داخلی ۵۰×۷۰×۷۰ سانتیمتر.
۲- صفحه دَوار که قابلیت چرخاندن ۶۰ سرنگ را به میزان ۱ دوردر دقیقه بود.
۳- سرنگهای شیشهای ۱۰۰ میلیلیتری.
۴- شیلنگهای سیلیکونی به میزان ۵ سانتیمتر برای هر سرنگ مجهز به گیره جهت جلوگیری از خروج گاز و موادغذایی از سرنگها.
۵- پمپ خلاء برای کشیدن مایع شکمبه.
۶- ترازوی دقیق با دقت یک ۰۰۰۱/۰ گرم.
۷- مواد شیمیایی برای ساختن محلولهای لازم
۸- وازلین
۹- کپسول گاز CO2
تجهیزات لازم برای پر کردن سرنگها که شامل:
– حمام آب گرم برای ثابت نگهداشتن درجه حرارت مایع شکمبه در حین پر کردن سرنگها
– پیپت جهت کشیدن مایع شکمبه.
– پیپت اتوماتیک برای کشیدن محلولها(بزاق مصنوعی و احیاکننده و. . . )
– گرمکن همراه با مگنت جهت گرم کردن و حل کردن اجزاء محلولها(منک[۷۶] و همکاران، ۱۹۷۹).

۳-۱-۷-۲- حیوان دهنده مایع شکمبه و ابزار گرفتن و آمادهسازی مایع شکمبه

در هر آزمایش پس از عادتپذیری حیوانات فیستولادار مورد آزمایش به مدت ۱۵ روز در حد اشتها، خوراک آنها به میزان حدود ۲۰-۱۵% کم شد وتغذیه آنها در سطح نگهداری قرار گرفت و پس از چند روز، دو روز متوالی برای اجرای آزمایش انتخاب گردید و گرفتن مایع شکمبه بهوسیله پمپ خلاء و از نظر زمانی صبح قبل از تغذیه صبحگاهی انجام گرفت.
۳-۱-۷-۲-۱- گرفتن مایع شکمبه