۳-۱-۷-۳-آماده سازی دستگاه

سه روز قبل از آزمایش دستگاه را شسته پس از اطمینان از کارکرد درست ترموستات و هواکش آن، کلیه سرنگهای دستگاه شسته و در آون ۶۰ درجه به مدت ۲۴ ساعت خشک شدند و نمونه آماده شده خوراکها در سرنگها ریخته و پس از این که پیستون کاملاً وازلین کاری گردید(این وازلین کاری باید کاملاً درست انجام شد و میزان آن نه آنقدر کم بود که چنانچه گاز نشت کرد نه آن قدر زیاد باشد که هم باعث اختلال در حرکت پیستون داخل سرنگ شود و هم به میزان زیادی به بیرون نشت نماید.) آن را با یک حرکت چرخشی متناسب داخل سیلندر سرنگ قرار دادیم و عدد آن را روی عدد ۳۰ میلیلیتر تنظیم کرده و با گیره مخصوص دهانه سرنگ را بستیم در این حالت هم حتماً بایستی گیره بسته باشد تا سرنگ در اثر فشار هوای ناشی از هواکش هیچ مقدار از ماده غذایی محتوی خود را از دست ندهد. دستگاه را روشن کردیم و ترموستات آن را برای دامنه دمای ۴۰-۳۹ درجه سانتیگراد تنظیم نمودیم تا پس از آمادهسازی سرنگها و انتقال آنها به دستگاه، سرنگها و مواد خوراکی محتوی آنها به مدت ۲۴ ساعت درون دستگاه گرم شدند(منک واستینگاس، ۱۹۸۸).

۳-۱-۷-۴-آماده سازی خوراک

نمونهبرداری صحیح از خوراک بایستی به صورت نمونهبرداری در مورد کیسه های نایلونی ذکر شد انجام گرفت. میتوان از نمونهای که درون کیسههای نایلونی ریخته شده بود برای آزمون گاز استفاده کرد ولی در این آزمایش مواد خوراکی را با استفاده از الک شماره ۵۶۵۷ ریز به قطعات ۱ میلیمتری خرد نموده و پس از عبور آنها از الک ۴۵ میکرونی برای گرفتن گرد و غبار برای هر سرنگ به میزان ۲۱۱/۰ الی ۲۱۶/۰ گرم ماده خوراکی را وزن و با قیف مخصوص بهطوری که هیچ ذرهای از ماده خوراکی به دیواره سرنگ نچسبد تمام ماده خوراکی در انتهای سرنگ ریخته شد و بعد پیستون در جای خود قرار گرفت و سرنگهای حاوی مواد خوراکی جهت گرم شدن به داخل دستگاه منتقل گردید.

۳-۱-۷-۵-آمادهسازی محلولها

فرمولهای محلولها و بعد طرز آمادهکردن آنهابشرح ذیل میباشد
محلول اول شامل:
۷/۵ گرم Na2HPO4، ۲/۶ گرم KHPO4، ۶/۰ گرم H2O7 X MgSO4 که با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده و حل گردید.
محلول دوم شامل:
۲/۱۳ گرم H2O2 x cacl2، ۱۰ گرم H2O 4 x MnCl2، ۱ گرم H2O 6 x CoCl2، ۸/۰ گرم H2O 6 x FeCl2 که با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلیلیتر رساندیم.
محلول بافر شامل:
۳۵ گرم NaHCO3 ، ۴ گرم HCO3 (NH4) که با آب مقطر به حجم ۱ لیتر رساندیم.
محلول ریزاسورین شامل:
۱۰۰ میلیگرم ریزاسورین که آن را با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلیلیتر رساندیم.
محلول احیاکننده شامل:
۲ میلیلیتر NaOH یک نرمال، ۲۸۵ میلیگرم H2O7 x Na2S و ۵/۴۷ میلیلیتر آب مقطر است.
این محلولها، پنج محلول مورد استفاده در این آزمون را تشکیل دادند. محلول احیاکننده بایستی در هر نوبت آزمایش و درست قبل از آن و تازه ساخته شد. امّا سایر محلولها را قبلاً ساخته و ذخیره گردید. پس از آمادهسازی محلولها طبق فرمول زیر بزاق مصنوعی و محلول اصلی بهکار رفته در این آزمایش را که به نسبت ۲۰-۱۰ با مایع شکمبه مخلوط گردید.(۲۰ سیسی بزاق مصنوعی و ۱۰ سیسی مایع شکمبه) ساخته شد: ۴۷۴ میلیلیتر آب مقطر، ۱۲/۰ از محلول دوم، ۲۳۷ میلیلیتر از محلول بافر، ۲۳۷ میلی لیتر از محلول اول، ۲۲/۱ از محلول ریزاسورین.
گاز CO2 از طریق یک لوله به داخل محلولها وارد شد خصوصاً هنگامی که محلول احیاکننده را اضافه کردیم این محلول آبی روشن بهتدریج با خروج اکسیژن از آن به یک محلول قرمز تبدیل شد و در نهایت بیرنگ شد که این نشانه عدم وجود اکسیژن در آن است. تا لحظه بیرنگ شدن محلول و خروج کامل اکسیژن ازآن ما مجاز به استفاده از آن نبودیم، سپس سرنگهای حاوی نمونه خوراکی را که گرم شدند از سر سرنگ و از طریق لوله پلاستیکی با حجم ۲۰ میلیلیتر از این محلول و ۱۰ میلیلیتر مایع شکمبه پر کرده و پس از تنظیم آن روی درجه ۳۰ میلیلیتر و محکم کردن گیره آن، سرنگ داخل دستگاه قرار داده شد و موتور گردنده را روشن نموده تا سرنگها دردمای ۳۹ درجه و چرخشی معادل ۱ دور در دقیقه در شرایطی مشابه به شرایط شکمبه عمل هضم و تولید گاز انجام شد.

۳-۱-۷-۶- آزمون گاز

پس از پر کردن هر سرنگ با نمونه ماده خوراکی، شیرابه شکمبه و محلول ساخته شده بزاق مصنوعی به طریقی که شرح آن داده شد سرنگی حاوی ۲۰ میلیلیتر محلول، ۱۰ میلیلیتر مایع شکمبه و حدود ۲۱۱/۰ تا ۲۱۶/۰ گرم ماده خوراکی بدست آمد و عدد پیستون هم روی ۳۰ میلیلیتر تنظیم شد و در حقیقت عدد ۳۰ که حجم مایعات داخل سرنگ است به منزله میزان گاز تولیدی در زمان صفر (V0) است. این سرنگها وسرنگهای بدون ماده غذایی مربوط داخل دستگاه در محل مخصوص قرارداده شد و روتور دستگاه روشن شد.
دمای انکوباتور در تمام طول آزمایش ۳۹ درجه سانتیگراد(با دقت ۱/۰ درجه سانتیگراد) بو.د یک افت جزیی در دما در هر مرحله آزمایش چه در زمان نمونهگیری مایع شکمبه که دمای آن با ترموس آب گرم در حد ۳۹ درجه سانتیگراد حفظ گردید و چه در مرحله تزریق مایع شکمبه به داخل سرنگها و چه در مرحله تولید گاز در دستگاه، اثر منفی کمتری داشت تا اینکه این دما در هر مرحلهای از ۴۰ درجه سانتیگراد بالاتر رود که این افزایش دما بهشدت روی طول عمر و جمعیت میکروبی و فعالیت میکروارگانیسمهای مایع شکمبه اثر داشت.
قرائتهای بعدی بدین طریق انجام شد، ۲ ساعت بعد(V2)، ۴ ساعت بعد(V4)، ۶ ساعت بعد(V6)، ۸ ساعت بعد(V8)، ۱۲ ساعت بعد(V12)، و بعد در زمانهای ۲۴ ساعت(V24)، ۴۸ ساعت(V48)، ۷۲ ساعت(V72) و ۹۶ ساعت(V96) که در این ساعات میزان گاز تولیدی اندازه گرفته شد و در جداول مربوط ثبت گردید. در هر ساعتی که پس از قرائت مشاهده شد که گاز تولیدی بیشتر از ۵۰ میلیلیتر گردیده، بر جلوگیری از اثر فشار روی میکروارگانیسمها و همچنین گیرکردن پیستون به دیواره داخلی دستگاه، پس از اینکه سر سرنگ رو به بالا قرار داده شد گیره را باز کرده و پیستون به سمت بالا حرکت داده شد تا مجدداً روی ۳۰ میلیلیتر قرار گرفت و مواظب شد که به هیچ وجه مایع از داخل سرنگ خارج نشود و بعد از زدن علامت در جدول مربوطه مجدداً گیره را بسته و سرنگ داخل انکوباتور قرار داده شد. در هنگام بالا بردن پیستون علاوه بر دقت کافی جهت عدم خروج مایع از سرنگ دقت زیادی شدکه بالا بردن پیستون با یک حرکت چرخشی انجام شد تا از عدم چسبیدن پیستون به دیواره سرنگ اطمینان حاصل شد.
در این آزمایش برای قرائت هر سرنگ درب انکوباتور باز گردیده و بلافاصله بسته شد و از خارج کردن چند سرنگ با هم جهت قرائت خودداری شد چرا که دمای سرنگها کم شود یا دمای داخل انکوبا تور پایین بیاید علاوه بر اثر سوء روی میکروارگانیسمها باعث انقباض وکم شدن حجم مایع و گاز داخل سرنگ شده و با مکشی که ایجاد میکند باعث کشیده شدن پیستون به داخل شده و باعث اشتباه در قرائت گاز تولیدی میگردد(منک واستینگاس، ۱۹۸۸).

۳-۱-۷-۷- محاسبه پارامترهای هضم‌پذیری

با استفاده از فرمول‌های زیر پارامترهای هضم‌پذیری محاسبه گردید(منک وهمکاران، ۱۹۸۸).
OMD = 14.88 + 0/889 Gas + 0/45 Cp + 0/0651 Ash(ماده‌آلی‌قابل‌هضم)
+ ۰/۰۰۰۲۸۶ EE2 ۰/۰۰۵۷ Cp = 2/2 + 0/136 Gas + ME(انرژی‌قابل‌متابولیسم)
SCFA = 0/0601 + 0/239 Gas(اسیدهای‌چرب زنجیره‌کوتاه)
NEL = ۰/۵۴ + ۰/۰۹۶ Gas + 0/0038 Cp + 0/000173EE2(انرژی‌خالص‌شیردهی)
Gas = گاز تولیدی در ۲۴ ساعت(میلی‌لیتر بر گرم ماده‌خشک).
Cp = پروتئین‌خام در ماده‌خشک.
EE = درصد مولی چربی‌خام در ماده‌خشک.

۳-۱-۸- روش طیف‌سنجی مادون قرمزنزدیک انعکاسی(NIRS)

به‌تازگی در بعضی ازآزمایشگاه‌ها، روش‌هایی همچون ترکیب روش‌های رگرسیون‌آماری با طیف‌سنجی مادون قرمزنزدیک انعکاسی مرسوم شده است.

۳-۱-۸-۱- تعیین شاخص‌های کیفیت با طیف‌ سنجی مادون قرمزنزدیک

پس از تعیین ترکیب شیمیایی نمونه‌ها درآزمایشگاه، باقی‌مانده نمونه‌ها برای کالیبراسیون مورد استفاده قرار گرفتند. برای اسکن‌کردن نمونه‌ها ازدستگاهpercon Inframatic8620 استفاده شدکه دارای بیست فیلتر ‌بود. درمجموع برای هرکدام از سه گونه یک برنامه کالیبراسیونی برای صفات مورد بررسی تهیه گردید. تکنولوژی طیفسنجی مادون قرمزنزدیک براساس جذب و انعکاس اشعه مادون قرمز در طول موج‌های بین ۱۱۰۰-۲۵۰۰ نانومتر استوار بود. در این روش اشعه بر جسم تابانیده شده و انرژی منعکس شده® از نمونه براساس log ۱/ R اندازه‌گیری شد. از هرگونه گیاهی بیست تکرار به‌طور مجزا در داخل محفظه‌های دستگاه قرارگرفته شد و با تابانیدن پرتوهای مختلف اشعه مادون قرمزنزدیک، صفات کیفی مورد نظر پیش‌بینی شد. حدود دو سوم نمونه نیز برای پردازش معادله کالیبراسیون و بقیه برای صحت دقت معادله کالیبراسیونی به‌کار برده شد. کالیبراسیون به ‌طور معمول با کاربرد رگرسیون خطی چندمتغیره[۷۸] براساس روش وسترهاوس[۷۹](۱۹۸۸) و با استفاده از نرم‌افزار Percon NIR Programs Version ۴/۸۹ معرفی شده شرکت Percon بود.

۳-۱-۸-۲- جست و جوی اتوماتیک فیلترها[۸۰]

برای تعیین بهترین کالیبراسیون به‌طور معمول از ترکیبات طول موج سه، چهار، پنج و شش‌تایی استفاده گردید. زیرا استفاده از همه بیست فیلتر با هدف بررسی کیفیت علوفه‌گیاهان ‌مرتعی هم‌سو نمی‌باشد. فیلترهای ‌برتر براساس کمترین اشتباه‌استاندارد کالیبراسیون(SEC)[81]، بیشترین ضریب تشخیص(R2)[82] و بیشترین مقدار آزمون F مشخص شد (احمدی، ۱۳۸۲).